A espécie Ilex paraguriensis St. Hil., conhecida popularmente como erva-mate, apresenta grande destaque no Brasil, principalmente na região Sul. Nessas regiões, os plantios de erva-mate apresentam produtividade mediana, o que pode estar relacionado com a utilização de mudas sem melhoramento genético. Aliado à isso, são restritas as informações básicas da genética dos indivíduos e populações, as quais norteiam a definição de estratégia de melhoramento. Com isso, o presente estudo teve como objetivo analisar a variabilidade genética de três populações comerciais de Ilex paraguriensis por meio do marcador ISSR. As amostras foliares foram coletadas no município de Ilópolis, Rio Grande do Sul, sendo realizada a etapa de extração do DNA no Laboratório de Melhoramento e Propagação Vegetativa de Plantas da Universidade Federal de Santa Maria-RS. As reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) foram realizadas no laboratório de Microscopia de Fluorescência da Universidade Federal de Santa Catarina, campus Curitibanos. Posteriormente, a visualização dos fragmentos obtidos pela PCR foi realizada em gel de agarose submetidos à eletroforese por aproximadamente duas horas com potência de 60 V. Dentre os iniciadores utilizados nas reações de PCR, seis apresentaram eficiência na amplificação da reação, sendo estas (I₁, I₂, I_4, O₆, F_11, F₁₂), através dos quais foi elaborada uma matriz binária. Não foram observados indivíduos com padrões de bandas repetidas, confirmando que os indivíduos coletados não são clones.  Através do teste de AMOVA foi detectada a maior variação genética dentro das populações, quando comparada à variação entre as populações. A Análise de Coordenadas Principais (PCoA) resultou em dois agrupamentos, mantendo duas populações reunidas. O marcador ISSR revela que existe variabilidade genética entre as populações de erva-mate, sobretudo variabilidade genética entre os indivíduos dentro da população.