O etanol de segunda geração (E2G) é obtido a partir do processamento de biomassas lignocelulósicas, como o bagaço da cana-de-açúcar — um subproduto da produção de etanol de primeira geração (E1G). Entretanto, vários obstáculos precisam ser superados para viabilizar a fermentação industrial do hidrolisado hemicelulósico (HH) — meio proveniente do pré-tratamento do bagaço da cana-de-açúcar com ácido sulfúrico diluído, como o lento consumo de xilose e a resistência aos inibidores, os quais prejudicam o desempenho de leveduras fermentadoras de pentoses como Spathaspora passalidarum. Nesse contexto, estratégias como a imobilização celular podem ser uma alternativa para conferir proteção às células e aumentar a produtividade volumétrica do sistema, além de facilitar sua reutilização durante o processo. O presente trabalho teve como objetivo propor uma metodologia para imobilização de S. passalidarum em bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com ácido sulfúrico diluído, visando aumentar a adesão de células ao suporte lignocelulósico e avaliar a fermentação do HH proveniente do pré-tratamento do bagaço para intensificar a produção de E2G. As células imobilizadas e as células livres foram submetidas a fermentações em modo batelada a partir do HH, com o intuito de comparar parâmetros de processo. Como resultado, a fermentação do HH com células de S. passalidarum imobilizadas em bagaço de cana-de-açúcar obteve fator de conversão Yp/s (0,35 gP/gS) e Yx/s (0,43 gX/gS); 1,3 e 5 vezes maior, respectivamente, comparado ao ensaio de células livres. Após 24 h de fermentação foi possível atingir produtividade de 0,153 gP/L/h e rendimento de 68,37% no ensaio com células imobilizadas, que também foram superiores aos parâmetros calculados para o ensaio com células livres. Esses resultados são promissores para a produção de E2G, principalmente considerando sua aplicação em processos contínuos ou batelada com reciclos.