A nanoemulsão de óleo de linhaça dourada (Linum usitatissimun) carregada com o extrato de macela (Achyrocline satureioides) (NE-ML) foi desenvolvida para o tratamento alternativo da mastite bovina. O presente trabalho investigou o potencial antimicrobiano da NE-ML contra diferentes espécies bacterianas, além de avaliar a liofilização, com o uso de crioprotetores, como método de conservação visando a manutenção da estabilidade físico-química e atividade antimicrobiana da NE-ML. Os ensaios microbianos foram realizados através do método de microdiluição em caldo com a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Já os ensaios de liofilização, foram realizados utilizando sete açúcares crioprotetores em concentrações diferentes, sendo as amostras contendo NE-ML adicionada dos diferentes crioprotetores foram submetidas a diversos testes antes de serem considerados para o ensaio de liofilização. Depois, as amostras foram ressuspendidas e avaliadas. A amostra que apresentou aspecto físico-químico mais adequado foi utilizada para um teste de microdiluição em caldo frente a S. aureus. A NE-ML mostrou atividade antimicrobiana frente a todas as cepas padrão das espécies bacterianas investigadas. A CIM para S. aureus, S. epidermidis e P. aeruginosa foi 5% (v/v). Para E. coli, a CIM foi 10% (v/v) e para S. typhimurium foi 40% (v/v). Quanto aos ensaios de liofilização, dentre os sete açúcares crioprotetores avaliados, i.e., frutose, glicose, lactose, maltose, manitol, sacarose e trealose, em diferentes concentrações, somente a sacarose apresentou resultados satisfatórios como crioprotetor. No entanto, a NE-ML, adicionada de sacarose a 20%, após a liofilização, mostrou um diminuição da atividade antimicrobiana, com um aumento da CIM de 5% para 20% (v/v). Assim, conclui-se que NE-ML possui atividade antimicrobiana contra bactérias gram-positivas e gram-negativas causadoras de mastite bovina e que a sacarose 20% atua como um promissor crioprotetor da NE-ML.