O câncer de mama é o mais frequente em mulheres. Atualmente, a confirmação diagnóstica do câncer de mama é realizada pelo exame imuno-histoquímico, porém, esse é um exame moroso que avalia uma baixa quantidade de células. Assim, novas ferramentas de diagnóstico laboratorial são necessárias para auxiliar o diagnóstico precoce. Nesse contexto, a citometria de fluxo é uma metodologia rápida, eficiente e precisa. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar os anticorpos anti-PDL1 e anti-CK19 e o número de aquisição da citometria de fluxo para a investigação de diagnóstico e prognóstico para o câncer de mama. Para isso, foi realizada a titulação e validação dos anticorpos anti-CK19 e anti-PDL1 em células de linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 e MCF-7. Além disso, foi avaliada a sensibilidade de recuperação de células neoplásicas PDL1+ no sangue periférico pelos métodos de Ficoll-hypaque e Bulk-lysis. Os resultados mostram que após marcação com 20 µL de anti-PDL1 houve aumento de aproximadamente quatro vezes da IFM nas células MC7 marcadas em relação ao controle de células não marcadas (controle negativo). Já a marcação das células MCF-7 com 2,5 µL e 5,0 µL de anti-CK19 mostrou um aumento aproximado do IFM de 59 e 65, respectivamente, em relação ao controle. Assim, optou-se pela utilização de 2,5 µL desse anticorpo, pois as células positivas ficaram bem separadas das negativas (controle). Em relação a padronização de células CK19 e PDL1 positivas no sangue periférico para investigação de êmbolos neoplásicos na circulação periférica, foi observado que a metodologia Bulk-lysis foi mais eficiente para detectar as células neoplásicas circulantes. Por fim, foi possível validar o uso da concentração de 20 µL para o anticorpo anti-PDL1 e de 2,5 µL para o anticorpo anti-CK19. O Bulk-lysis foi selecionado como a metodologia a ser utilizada para a detecção de êmbolos neoplásicos na circulação periférica, e definido a aquisição de pelo menos 5 x 10⁶ de eventos em cada tubo.