O Brasil é um dos maiores produtores de etanol do mundo, que utiliza a sacarose da cana-de-açúcar como fonte de carbono. A produção de etanol de primeira geração (E1G) gera toneladas de bagaço da cana como resíduo agroindustrial, sendo um potencial produtor de etanol de segunda geração (E2G), que utiliza biomassa lignocelulósica como fonte de carbono, possibilitando o aumento da produtividade de etanol do processo, sem ampliar a área de plantio da cana-de-açúcar. Os materiais lignocelulósicos são compostos por celulose (30-50%), hemiceluloses (20-40%) e lignina (10-20%). Apesar da levedura mais empregada para a produção de E1G, Saccharomyces cerevisiae, não ser capaz de assimilar eficientemente a fração de pentoses fornecida pelas hemiceluloses, microrganismos naturalmente capazes de fermentar pentoses ganham destaque para a produção de E2G, como a levedura Spathaspora passalidarum. Além disso, o desempenho da produção de E2G é prejudicado pela formação intrínseca de inibidores, que são liberados a partir do processamento da biomassa, sendo necessário a implementação de estratégias para minimizar tais efeitos, como a imobilização celular. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar as condições ótimas de imobilização de S. passalidarum em bagaço de cana-de-açúcar, com a variação dos meios de cultura no processo de imobilização. O ensaio de imobilização apresentou um fator de retenção de 0,0745 g/g (células/bagaço) após 30 h de experimento, confirmando a possibilidade de imobilizar a levedura neste suporte. Ao avaliar a influência dos meios de fermentação na etapa de imobilização, os dados de retenção celular não apresentaram variações significativas, indicando que os meios avaliados não influenciaram a adesão das células ao suporte. Os resultados deste estudo se mostraram promissores para a aplicação das células de S. passalidarum imobilizadas em processos fermentativos, visando a produção de E2G.