Eugenia uniflora L. (pitangueira) é uma espécie-chave da Mata Atlântica e pertencente à família Myrtaceae. A pitangueira apresenta importância ecológica, produz óleos essenciais e compostos secundários para elaboração de cosméticos e fitoterápicos, e seus frutos são utilizados na fabricação de alimentos processados. O presente trabalho objetivou o desenvolvimento de um protocolo para organogênese in vitro de pitangueira. Sementes maduras foram germinadas em vasos (estufa), ou em tubos de ensaio (in vitro). Segmentos nodais de plântulas da estufa e in vitro foram desinfestados, segmentados, introduzidos em meio de verificação e transferidos para meio de indução organogênica composto por meio MS suplementado com 0,5µM de ANA e diferentes concentrações de BAP. Os experimentos ocorreram em delineamento completamente casualizado (DCC), contendo cinco tratamentos com vinte repetições para explantes da estufa ou para explantes in vitro. Ao final dos experimentos, foram avaliadas as porcentagens de explantes contaminados e explantes que apresentaram resposta organogênica. Os dados das variáveis de número de brotações e número de folhas por vitroplanta foram submetidos ao teste de Duncan (p>0,05) e regressão linear simples. Apenas 5% das sementes introduzidas in vitro contaminaram e 92,5% germinaram. Após 60 dias em meio de indução organogênica, obteve-se apenas cinco vitroplantas dos explantes oriundos da estufa devido à contaminação. Ocorreram contaminações em apenas 4% dos explantes de plantas germinadas in vitro. O tratamento com 0,5 µM ANA + 2,5 µM BAP gerou uma média de 1,47 brotações e 6,6 folhas por vitroplanta. A clonagem de genótipos selecionados de pitangueira é promissora, entretanto, métodos de desinfestação devem ser estudados para materiais de campo ou estufa. A organogênese a partir de segmentos nodais de plantas de pitangueira geradas in vitro é efetivamente induzida em meio MS suplementado com 0,5 µM de ANA e 2,5 µM de BAP.