A Guadua chacoensis pertence à família Poaceae. No Brasil, a produção em larga escala de bambus apresenta gargalos quanto a sua cadeia produtiva. Por esta razão, o objetivo deste trabalho foi verificar a sobrevivência e avaliar o comportamento e desenvolvimento de plantas micropropagadas da espécie Guadua chacoensis advindas de meio de cultura MS suplementado com três diferentes reguladores de crescimento: Metatopolina (MTOP), Tidiazuron (TDZ) e 6-Benzilaminopurina (BAP), submetidas ao processo de multiplicação, pré-aclimatização e aclimatização em três diferentes substratos: areia grossa lavada, composto peneirado+areia (1:1) e solução MS+areia, e rustificação. Foram realizadas análises de altura da touceira, número de colmos, comprimento de raiz, índice de multiplicação e fluorescência da clorofila a do Fotossistema II. Na fase de multiplicação, plantas cultivadas em meio suplementado com MTOP apresentaram a maior média de altura da touceira (7,04), para comprimento de raiz, foi observado maior média em BAP (11,68). Para o número de colmos e índice de multiplicação, MTOP apresentou as maiores médias (7,15 e 1,4 respectivamente). Na pré-aclimatização, plantas cultivadas em MTOP (8,36 cm) e BAP (7,75) tiveram as maiores médias de altura da touceira e para comprimento de raiz, (10,92) e (9,79). Para número de colmos, plantas vindas de meio com TDZ apresentaram a maior média (10,07). Na fase de aclimatização, as plantas vindas de MTOP (9,70) e BAP (9,61) apresentaram as maiores médias, o que também ocorreu para número de colmos (7,44) e (7,22), respectivamente. Plantas procedentes de meio suplementado com BAP chegaram à estabilidade de rendimento fotoquímico mais rapidamente. Plantas provenientes de meio suplementado com MTOP apresentaram maior taxa de sobrevivência na rustificação. Conclui-se que para os diferentes parâmetros analisados, o regulador de crescimento MTOP foi o melhor desde a fase de multiplicação até a aclimatização e rustificação das mudas.